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news 2025/7/1 16:27:52

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准备数据集：

A test data set composed of 5 tomograms of immature HIV-1 dMACANC VLPs, which is available at EMPIAR-10164.
原始倾斜系列数据需要是单独的影片或单独的运动校正图像，但不是组合倾斜系列堆栈。
mdoc 文件包含每个倾斜系列的元数据。

创建项目

创建一个项目目录，建议一个tomo对应一个目录，比如现在要重建TS_01断层图，则进入TS_01目录，运行：

relion --tomo&

预计算结果可以在这里下载作为参考：https://doi.org/10.5281/zenodo.11068319

显示如下界面：
在这里插入图片描述

导入断层图 Import

在这里插入图片描述
将创建一个名为 ImportTomo/job001/ 的目录，以及指向此目录的符号链接 ImportTomo/tilt_series。在新创建的目录中，将创建一个 tilt_series.star 文件。它包含一个表，其中每个倾斜系列都有一个条目。对于每个倾斜系列，单独的 starfile 包含从输入图像和 mdoc 文件中提取的相关元数据。输入以下内容查看这些内容：

less Import/job001/tilt_series.star
less Import/job001/tilt_series/TS_01.star

运动校正 Motion Correction

如果不需要运动校正可以省略该步骤。在import那里可以将Movies already motion corrected设置为yes。

input
建议保存用于去噪的图像：

在这里插入图片描述
Motion 面板：

Bfactor：对于自己的数据，如果 SNR 特别低可能需要增加此值。对于超分辨率movies，增加 B factor也可能有帮助。
Number of patches X,Y: 由于每个帧中的电子剂量太少，最好不要使用基于块的运动校正。
Binning factor：原始图像是在超分辨率模式下收集的，尚未缩放。这将把图像缩放到 1.35 Å。
教程数据已经过增益校正，因此不需要“增益参考图像”，所以该字段应留空。

运动校正颗粒将输出到 MotionCorr/job002/ 目录中。包含输入到其他作业所需的所有元数据的输出star文件将保存为 MotionCorr/job002/corrected_tilt_series.star。可以再次查看它引用的star文件，通过键入以下内容查看有关运动校正的累积元数据：

less MotionCorr/job002/tilt_series/TS_01.star

在这里插入图片描述

CTF estimation

CTFFIND-4.1 executable：安装的ctffind路径
Use power spectra from MotionCorr job? 使用运动校正期间保存的功率谱来估计 CTF 参数。
Minimum resolution:：用于 CTF 估算的最低分辨率。对于自己的数据可能需要更改这些值。
Maximum resolution：用于CTF估算的最高分辨率。
Minimum&Maximum defocus value：请注意，使用下面的“Nominal defocus search range”字段，该值就会被忽略。
Nominal defocus search range：（如果给出了正值，则散焦搜索范围将设置为输入 STAR 文件中标称散焦值的 +/- 此值（以 A 为单位）。标称散焦将从 mdoc 文件中提取。使用此选项时，请确保每个倾斜系列的输入星文件中都存在正确的值。如果为此字段给出零或负值，则将使用上面的整体最小-最大散焦搜索范围。）
Dose-dependent Thon ring fading (e/A2): 如果给出正值，则 CTF 估计的最大分辨率将降低 exp(dose/this_factor) 乘以上面指定的原始最大分辨率。请记住 exp(1)~=2.7，因此对于 $100 e/A^2$ 的累积剂量，此因子的值为 $100 e/A^2$ 将产生 2.7 倍更高的最大分辨率数（即 2.7 倍更低的分辨率）；较小的值将导致最大分辨率衰减更快。如果给出零或负值，则将对所有图像使用上面指定的最大值。

刚开始装了CTFFIND-4.1.14，结果会发生报错：
在这里插入图片描述
GitHub上也有人反应这个问题，目前我的解决方案是下载了较低版本的CTFFIND的，降级到4.1.10可以成功运行。后续 RELION 或许会改掉这个bug，可以关注一下。

可查看输出：

less CtfFind/job003/tilt_series/TS_01.star

通过检查 CtfFind job 的 tilt_series 目录中的star文件来检查几个倾斜系列的散焦值。rlnDefocusU 和 rlnDefocusV 列指定估计的散焦值。

此外，logfile.pdf 文件包含所有显微照片的有用参数图，例如散焦、像散、估计分辨率等，以及整个数据集中这些值的直方图。分析这些图可能有助于发现数据采集中的问题。

最后，还可以使用 relion_dislay 命令查看倾斜系列中每个倾斜图像的估计 CTF 的功率谱：

relion_display --gui --i CtfFind/job003/tilt_series/TS_01.star

Exclude tilt-images

选择input后会打开Napari，通过取消勾选其名称旁边的框，然后单击右下角的“保存倾斜系列 STAR 文件”来执行此操作。

Align tilt-series

在重建断层扫描图像之前，必须对齐每个倾斜系列。为此，RELION 5 实现了 IMOD 或 AreTomo 的包装器。对于教程数据集，我们将使用 IMOD 的基于基准的对齐，因为原始数据包含 (10 nm) 金珠作为基准标记。对于您自己的数据，您可能希望使用各种倾斜系列对齐方法，然后比较每种方法生成的断层扫描图像的质量（参见下一步）。

这里记得要修改imod的路径：
在这里插入图片描述

IMOD这里选Yes，AreTomo2那里选No：
在这里插入图片描述

Reconstruct tomograms

选择对齐之后的tilt series，denoising这里选yes
在这里插入图片描述

Unbinned tomogram width：这是重建断层扫描图像的 X 维度，以体素为单位。我们使用的断层扫描体积比图像的实际尺寸（3710 x 3838）略大，这样如果图像旋转，所有像素仍将位于断层扫描图像中。由于我们在下面使用较大的binned 像素，因此磁盘空间成本不会太高，但可以对其进行调整以获得稍小的断层扫描图像。
Unbinned tomogram height : 同上。
Unbinned tomogram thickness：这是断层图像的 Z 维度，以体素为单位。对于教程数据，2000 个体素封装了所有五个断层图像的信号。对于自己的数据可能需要测试几个值，以确保断层图像厚度不会太小而无法包含整个样本。如果打算稍后对断层图像进行去噪，最好不要选择比样本厚度大得多的断层图像厚度，因为去噪协议会从断层图像中随机提取子断层图像，而不希望有太多没有信号的子断层图像。
Binned pixel size: 10 埃的像素大小足以进行粒子拾取和去噪。通常像素大小越大，断层图像重建速度越快，断层图像占用的磁盘空间越小。

在这里插入图片描述

教程断层扫描图的质量非常好，不需要去噪；但是，我们将其设置为“是”，以便在下一步演示去噪。(此设置需要在运动校正作业中将“保存图像进行去噪？”设置为“是”。）
如果“生成断层图用于去噪？”设置为“否”，则输出断层图将被称为 Tomograms/job006/tomograms/rec_TS_01.mrc 等，否则将被称为 Tomograms/job006/tomograms/rec_TS_01_half<1/2>.mrc。然后可以在您最喜欢的查看器中查看它们，包括 IMOD 的 3dmod 或 Napari。这些断层图的主要目的是评估样本的质量并允许拾取粒子。此时它们不需要包含高分辨率信息。